普林斯顿大学Todd K. Hyster教授团队报道了一种基于PLP依赖型L-苏氨酸醛缩酶（TmLTA）的光酶催化体系，通过定向进化改造酶蛋白，并结合外源光敏剂罗丹明6G（Rh6G）的Förster共振能量转移（FRET）机制，成功实现了苄胺类底物与还原性自由基前体的不对称自由基-自由基交叉偶联（ARC）。该反应在温和条件下高效构建C(sp³)-C(sp³)键，产物具有优异的手性选择性（最高达99:1对映体比），并展示了广泛的底物适用范围，包括嘧啶类、吡啶类以及多种取代苄基、烯丙基自由基前体。研究还揭示了酶内FRET新机制——激发态外醛亚胺可通过同源四聚体结构将能量传递至相邻活性中心的醌式中间体，显著提升了光能利用效率。该工作为光酶催化提供了全新的辅酶激活策略，并展示了其在复杂药物中间体合成中的应用潜力。相关论文以“Pyridoxal photoenzymes for asymmetric radical–radical cross-couplings”为题，发表在Nature上，第一作者为Cole C. Sorensen和Suhao Wang。

野生型活性发现与定向进化

研究团队首先以嘧啶甲胺（2a）和苄基吡啶鎓盐（1a）为模型底物，对实验室现有的L-苏氨酸醛缩酶库进行筛选。实验表明，野生型TmLTA在Rh6G存在下能够以5%的收率和99:1的对映体比得到C(sp³)-C(sp³)偶联产物3a，而缺乏Rh6G时收率仅1%，证实了外源光敏剂对激发醌式中间体的必要性（图2a）。对照实验表明，光和TmLTA均为促进该反应所必需的条件。此外，直接激发丙氨酸衍生醌式中间体尝试光酶活性时未能得到产物，凸显了额外激发态稳定化的重要性。值得注意的是，该酶在前期研究中已被改造用于苄胺的天然醛缩酶活性，但先前工程化变体TmLTA EAGD在此光反应中完全不具活性，说明光酶反应对活性位点有独特的结构需求。

图1：光酶辅酶体系的拓展。 a，“暗空间”中具有不同活性的发色团辅酶，突出显示了PLP的相关中间体。b，DNA光解酶的简化机制及其两种相关辅酶的紫外-可见吸收光谱。c，本研究工作及所提出的不对称自由基-自由基交叉偶联（ARC）反应机理。[Py]：1,3,5-三苯基吡啶鎓四氟硼酸盐。

为进一步提升反应效率，团队采用定点饱和突变策略对TmLTA进行定向进化（图2b）。基于野生型和底物结合态晶体结构，他们选取了与活性相关的关键残基（如K199、H83、R316）以及辅酶结合口袋附近的位点。在降低胺用量至2当量（常规PLP光酶体系需5当量以上）的条件下，第一轮突变Y30E使收率提升至8%；随后保守羧酸结合精氨酸突变为谷氨酰胺（R316Q）将收率进一步提高至13%；组合突变N308L和I124S得到第四代变体，收率达30%；最终引入V310L突变后，产物收率跃升至90%，对映体比保持99:1。所有五个突变位点均位于CAVER和KVFinder预测的底物通道三个独立环区（图2c）。该最终变体在降低酶用量至0.5 mol%时仍保持79%收率，在1当量胺条件下保持38%收率和99:1 e.r.。无细胞裂解液中活性可维持（93%收率，99:1 e.r.），在0.01 mol%酶载量下总转化数（TTN）高达700（图2d）。

图2：针对自由基反应性的蛋白质工程改造。 a，TmLTA催化模型反应条件。反应条件：1a（2.5 μmol，1当量），PLP（磷酸吡哆醛，基于1a为10 mol%），2a（2当量，10 μmol），TmLTA（基于1a为1 mol%）溶于100 mM KPi pH 8.0缓冲液，含7.5% MeCN，总体积800 μL。b，TmLTA定向进化历程概述（针对1a与2a的反应，2当量，10 μmol），显示收率和对映体比的提升。c，TmLTA EQLSLG蛋白活性位点，突出显示链1、2、3的环区，映射至TmLTA EAGD晶体结构（PDB：9E97）。d，TmLTA EQLSL无细胞裂解液反应活性。[Py]：1,3,5-三苯基吡啶鎓四氟硼酸盐。

底物适用范围研究

工程化变体TmLTA EQLSL对嘧啶类底物展现出良好的兼容性（图3）。模型底物2a可在250微摩尔规模上以86%收率和99:1 e.r.制备。4-位和5-位取代的嘧啶底物（3b-g）均可顺利反应；对于部分低表现底物，胺用量可从2当量增至5当量以改善收率（图3括号内数值）。卤素系列（3e-g）收率和对映选择性依次降低；大位阻取代基如4-茚满醇嘧啶（3i）仍可获得51%收率，但对映选择性有所下降。在自由基前体方面，间位取代苄基自由基（3r-t）表现出中等收率和高手性选择性，邻位取代（3q、3t）则观察到轻微的对映选择性下降。令人惊喜的是，吡啶基和烯丙基自由基前体也能有效参与反应，为未来拓展更具挑战性的自由基类型提供了可能。具有额外手性中心的甲基苄基自由基底物（3w）以高手性选择性和非对映选择性得到产物。

图3：自由基-自由基交叉偶联反应的底物范围。 嘧啶类底物：1a（5.0 μmol，1当量），2a-w（2当量，10 μmol），PLP（基于1a为10 mol%），TmLTA EQLSL（基于1a为1 mol%）溶于100 mM KPi pH 8.0缓冲液，含7.5% MeCN，总体积800 μL。⁎使用0.25 mol%酶载量和5当量胺。†使用5当量胺。‡使用5当量胺。吡啶类底物：1a（5.0 μmol，1当量），4a-m（10当量，50 μmol），TmLTA EQLSLG（基于1a为1 mol%）溶于100 mM KPi pH 8.0缓冲液，含7.5% MeCN，总体积800 μL。使用外消旋起始胺（4l）。[Py]：1,3,5-三苯基吡啶鎓四氟硼酸盐。

鉴于苯基、吡啶基和嘧啶基是FDA批准药物中最常见的三种六元芳环，团队进行了“脱氮底物行走”策略，将方法拓展至吡啶类底物。吡啶甲胺（4a）因吸电子能力较弱而pKa较高，对醌式形成构成挑战。对TmLTA进行额外一轮定点突变后（+S6G），变体TmLTA EQLSLG在10当量胺条件下可将收率从32%提升至78%，对映体比保持99:1。吡啶类底物（5a-k）的反应趋势与嘧啶类相似：5-位取代因指向Loop D区域而降低醌式形成收率；3-位取代耐受性良好但氟代变体无活性；6-位取代产物收率尚可但完全失去对映选择性，提示吡啶氮原子的关键相互作用。溴代底物5i和5j因发生光还原副反应生成5e（分别生成25%和24%的5e），但总收率（41%和42%）表明初始结合和产物形成良好。另一种底物5k也观察到类似的对映选择性丧失。尤为突出的是，苄基取代底物5l以8%收率和99:1 e.r.得到α-叔胺产物——这类结构传统上极其难以合成，无法通过转氨酶或亚胺还原酶等经典生物催化剂实现。

光敏剂FRET机制与酶内能量转移

机理研究表明，直接使用505 nm LED激发醌式[Q]仅能获得16%收率，而470 nm LED激发Rh6G则使收率大幅提升至90%（图4a）。Stern-Volmer淬灭实验证实，酶结合醌式是唯一能淬灭Rh6G激发态的反应组分（图4b）。荧光光谱观测到Rh6G激发态向醌式的FRET现象（图4c），其效率源于供体发射光谱与受体吸收光谱的良好重叠（图4c插图）。有趣的是，随着定向进化推进，Rh6G荧光淬灭速率逐渐加快（动态淬灭机制），团队推测柔性非极性残基的引入增大了活性腔体积和醌式中间体的构象自由度，有利于与Rh6G激发态的偶极对齐。值得注意的是，在整个进化过程中，平衡态醌式形成与收率之间并无相关性，且醌式中间体在470 nm辐照下的厌氧光稳定性随每轮突变而降低，并在Rh6G存在时进一步加剧。

更为重要的是，团队发现无需光敏剂时，445 nm LED直接激发酶结合外醛亚胺[A]也能获得62%收率，且该效率在进化过程中同步提升（图4d）。此前研究虽发现溶液中游离醛亚胺可作为光还原剂，但酶结合态[A]的激发光催化尚未被充分探索。荧光光谱揭示了TmLTA同源四聚体内的FRET机制——[A]⁺通过酶内FRET将能量传递给相邻活性中心的醌式[Q]（图4e）。时间分辨荧光显示[A]⁺呈双指数衰减（4.87 ns和1.35 ns），而三个相邻活性中心辅酶距离约3、4、5 nm且取向良好。这种利用蛋白质四级结构实现高效能量传递的现象，为光酶催化设计提供了全新思路。

图4：Förster共振能量转移机理研究。 a，生成[Q]⁺的FRET机制。b，罗丹明6G激发态被由2a生成的酶结合醌式中间体淬灭的Stern-Volmer图。c，罗丹明6G向醌式中间体的外源性FRET。d，2a激发态外醛亚胺与（e）TmLTA EQLSL同源四聚体中相邻醌式之间的酶内FRET。

激发态醌式性质与反应机理

进一步对醌式激发态[Q]⁺的Stern-Volmer淬灭实验表明，吡啶鎓盐1a能有效淬灭[Q]⁺荧光（图5a），证实了激发态醌式作为强还原剂将自由基前体还原引发交叉偶联的假设。时间相关单光子计数测得源自2a的醌式激发态寿命（图5b），不同TmLTA变体表现出可分辨的荧光寿命差异。氧化还原性质计算显示，[Q]⁺的激发态还原能力足以还原多种自由基前体（图5c）。作为应用验证，团队利用该体系实现了噻吩鎓盐（thianthrenium salt）这类非稳定化自由基前体的偶联反应（图5d），并通过对照实验确认了自由基-自由基偶联路径（图5e）：当使用非手性亲电试剂替代吡啶鎓盐时，仅得到外消旋产物，证实了酶活性中心对立体化学的控制作用。整体反应机理可概括为：光敏剂或外醛亚胺通过FRET激发醌式中间体，[Q]⁺还原吡啶鎓盐生成碳自由基，随后在酶活性中心手性环境的精确控制下，两个自由基发生不对称交叉偶联（图5f）。

研究最后展示了该方法在药物合成中的实用性——HIV衣壳抑制剂Lenacapavir关键手性胺中间体（4m）的合成（图5g）。在18 mM胺底物、3 mM自由基前体、50 nmol酶和0.5 μM Rh6G的条件下，成功构建了高度官能团化的核心胺结构，凸显了该光酶催化体系在复杂药物分子后期官能团化中的潜力。

图5：激发态醌式的机理与应用。 a，醌式激发态（由2a生成）被1a淬灭的Stern-Volmer图；插图为随1a浓度增加母体发射光谱的变化；[TmLTA EQLSL] = 30 μM，[2a] = 1.67 mM。b，醌式荧光寿命的时间相关单光子计数；[TmLTA变体] = 30 μM，[2a]或[4a] = 1.67 mM。c，源自2a的[Q]基态和激发态氧化还原性质预测及计算值，与其它还原性偶联伙伴的对比。d，2a（2当量，10 μmol）与噻吩鎓盐（非稳定化自由基前体）的光酶反应。e，醌式直接自由基加成的对照反应。f，所提出的反应机理。g，Lenacapavir高度官能团化核心胺4m的合成：18 mM 4m，3 mM 3m，TmLTA EQLSLG 50 nmol，Rh6G 0.5 μM。

总结与展望

本研究首次将PLP辅酶的激发态醌式中间体用于不对称自由基-自由基交叉偶联，通过定向进化与FRET机制相结合的策略，克服了醌式低吸收和短寿命的固有局限。该体系不仅实现了传统化学和生物催化难以企及的α-叔胺等手性中心的高效构建，还揭示了酶四级结构介导的“酶内FRET”新机制，为开发利用蛋白寡聚态进行光能传递的通用策略奠定了基础。随着对醌式光物理性质认识的深入和酶工程技术的进一步发展，PLP依赖型光酶有望成为不对称自由基合成的新平台，为药物发现和复杂分子创制提供更强大的工具。