基因治疗和反义疗法通过将核酸递送至靶细胞，为治疗遗传性和获得性疾病带来了巨大希望。尽管病毒载体因其高效性在临床上占据主导地位，但其应用受限于免疫原性、致癌整合风险、有限的载货能力和复杂的生产工艺。脂质纳米颗粒虽取得了临床成功，但其固有的肝趋向性限制了肝外靶点的递送。在此背景下，合成聚合物因其安全性、可调控性和可规模化生产而成为非病毒载体的有力竞争者。然而，传统聚合物常面临结构异质性强、药代动力学不可预测以及内体逃逸效率低下等挑战——聚合物链在分子量、单体组成、序列和立构化学上的差异，导致纳米复合物的理化性质多变，并引发剂量依赖性细胞毒性和不可预知的胞内行为，严重阻碍了其临床转化。这些挑战促使研究者寻求从统计混合物走向完全分子精度的设计策略，而序列定义聚合物正是这一趋势的核心。

针对上述挑战，塔斯马尼亚大学Cameron W. Evans博士和西澳大学K. Swaminathan Iyer教授合作，系统阐述了序列定义聚合物在基因递送领域的发展前景。该综述指出，与传统分散聚合物不同，序列定义聚合物具有一致的分子量，其单体种类、排列顺序、间距和拓扑结构均可精确编码，从而为建立可靠的结构-功能关系、克服生物屏障、实现靶向组织递送提供了前所未有的机会。论文通过整合聚合物科学与生物学效应，构建了一个战略性框架，旨在攻克非病毒基因递送中长期存在的难题，推动基因治疗走向可预测、可重复的临床实践。相关论文以“Sequence-defined polymers for predictable gene delivery”为题，发表在Nature Reviews Chemistry上。

综述开篇从聚合物化学结构的多样性入手，描述了从线性阳离子均聚物到复杂支化结构的演变（图1a）。最简单的线性聚阳离子如聚赖氨酸和线性聚乙烯亚胺虽能有效压缩核酸，但其转染效率与细胞毒性直接相关——高电荷密度在促进细胞摄取的同时也带来膜损伤风险。通过引入不带电的第二单体形成无规共聚物、嵌段共聚物或具有可电离侧链的聚合物，可以部分缓解毒性问题，但这些体系在传统聚合方法下仍局限于简单的单体排列模式。序列定义聚合物则能实现分子量的均一化（图2a）、共聚物中单体次序与间距的精确控制以及立构化学中心的精准排布（图2b）。

图1 | 聚合物是核酸递送的关键参与者，该领域正向精确的序列定义大分子迈进。a，聚合物在核酸凝聚、内化和亚细胞运输中发挥积极作用。b，分子量、组成、序列或支化程度不均匀的分散聚合物表现出可变的理化性质和不可预测的胞内递送行为，导致转化潜力有限。不同颜色的球体代表不同的单体。c，序列受控聚合物是分散的但组分嵌段有序排列；注意单体的顺序保持不变但单体数目不同。序列定义聚合物含有数目精确相等且序列精确排列的单体，从而形成均一的聚合物群体。

对于支化聚合物，如广泛使用的25 kDa支化聚乙烯亚胺，其三维电荷分布和分子柔性与线性聚合物有本质差异，通常能更有效地压缩DNA并形成更小更稳定的多聚复合物。然而，增强的多价膜相互作用也带来更严重的剂量依赖性细胞毒性。尽管部分乙酰化、聚乙二醇化或糖基化修饰可降低毒性，但随机修饰反而加剧了产物异质性。序列定义在这一体系中的价值在于可控地放置支化点和调控支链组成（图2c），有望打破效率与毒性之间的权衡。树状大分子是另一类代表性体系，其逐级生长的特性天然赋予了序列定义——每一代合成产生一个离散的壳层（图2d）。高代数树状大分子虽转染效率提高但细胞毒性增加，通过外围基团修饰可进行调节。目前第四代异层树状大分子已可在2.5小时内通过一锅法高效合成，且Janus树状大分子等非对称结构正在成为研究热点，其异构体效应已展现出对体内行为的精确调控潜力。对于超支化聚合物、聚合物刷和树枝化聚合物等更复杂的拓扑结构，序列定义的引入可以在结构多样性和功能精确性之间取得折中，即便仅在部分组分中实现精确排列也能显著提升整体性能（图2e）。

图2 | 在不同聚合物架构中引入序列定义的优势。a，均聚物中的序列定义只是一个平凡的例子，仅用于获得一致的分子量。b，共聚物体系中的序列定义还可以实现均一的组成（单体的比例和排列次序）、共聚单体之间明确的间距以及立构中心的精确排布。不同颜色的球体代表不同的单体。c，在支化架构中，序列定义带来支化点的可控放置以及支链的明确组成和分子量。d，在树状大分子架构中，分子量通常已得到良好控制，但序列定义允许按特定顺序放置单体，从而产生高度复杂的支化聚合物并实现优异控制。e，在单一聚合物中同时包含随机（分散）组分和序列定义组分的杂化架构，有助于在保留序列定义诸多优势的同时，克服复杂性和成本方面的限制。在该子图中，浅粉色球体代表传统的分散（共）聚合物，红色和蓝色球体代表序列定义聚合物组分中的单体。

聚合物结构的精确性如何转化为生物学功能的优化？综述指出，从外源核酸到转基因表达的全过程充满相互矛盾的需求（图3）。多聚复合物必须在生理条件下保持足够稳定以防止核酸提前释放，同时又必须在进入细胞后能够适时解装配以实现治疗功能（图3a）。在血液循环中，聚乙二醇化修饰赋予的“隐形”效应可延长循环时间并减少蛋白冠形成，但这种屏蔽在细胞层面同时也削弱了摄取和内体逃逸能力（图3b）。序列定义的优势就在于能够通过精确编码，使聚合物在不同阶段展现不同的行为——而非依赖单一静态特性。在细胞摄取环节，阳离子复合物主要通过静电吸附内吞进入细胞，但疏水性修饰（烷基、酰基或含氟基团）可进一步增强膜相互作用（图3c）。近年的研究发现，同时含有咪唑和胍基的两性离子聚合物能模拟细胞穿透肽的行为，显著促进摄取。此外，通过精确调控电荷密度和间距，可以调节核酸结合强度与膜相互作用的平衡，这为序列定义聚合物提供了独特的设计空间。

胞内运输中最关键的瓶颈是内体逃逸。绝大多数内化的多聚复合物最终被运往溶酶体降解，只有极少数能够逃逸至胞质发挥功能（图3d）。传统的“质子海绵假说”认为聚合物在内体中缓冲质子并引发渗透胀破，但近年高分辨成像研究揭示，成功逃逸更多涉及瞬时的膜不稳定化和局部孔隙形成，而非灾难性的囊泡破裂。逃逸通常发生在一个狭窄的时间窗口——即早期内体向晚期内体转化的阶段。刺激响应型聚合物因此成为研究热点。通过在聚合物链中精准排布阳离子和疏水结构域，可以实现pH选择性的内体膜扰动。而含有缩酮、缩醛、腙、亚胺或原酸酯等酸敏感键的聚合物，可在内体酸性环境（pH 5.5-6.5）中选择性降解，实现时空可控的核酸释放。此外，二硫键等氧化还原响应元素利用胞质中高浓度谷胱甘肽触发降解，为免除外源刺激的智能递送提供了途径。自消除聚合物则能响应温度、光、pH、酶、代谢物等多种信号启动解聚。这些设计中，序列定义所提供的位置精确性使得多功能基团的协同作用得以实现——例如，聚乙二醇外壳在循环中屏蔽识别，而在内体酸化后重排暴露膜裂解肽以促进内体逃逸（图3e-f）。

图3 | 聚合物基因递送载体所面临的相互竞争且依赖环境的需求。该图说明，单一的聚合物-核酸复合物在沿递送路径前进时必须表现出不同的、甚至往往是矛盾的行为，这推动了具有条件可控特性的聚合物的设计。a，多聚复合物的形成需要足够的静电凝聚和稳定性以在胞外和血清条件下保护核酸货物，同时保留胞内解装配的能力。b，表面化学和电荷呈递决定了循环、蛋白质吸附和清除过程，凸显了“隐形”行为与下游细胞相互作用之间的权衡。c，细胞摄取主要受静电或配体介导的相互作用支配，聚合物的电荷密度、间距、疏水性和靶向基序影响内吞途径的选择及后续运输。d，内吞后，在内体成熟过程中的一个狭窄时间窗口内，由瞬时的局部聚合物-膜相互作用（而非不加区分地破坏囊泡）促进逃逸至胞质。e，逃逸后，多聚复合物经历不同的命运，包括胞质扩散、细胞骨架辅助运输、核内转运或降解。f，聚合物在递送过程中需要保持稳定，但工程化的可降解或刺激响应键可促进货物释放，而大分子的裂解或分解是促进清除所必需的。综合来看，这些图示表明有效的递送要求聚合物的序列能够编码环境特异性行为，而非依赖单一静态特性。

序列定义聚合物的合成方法学也在快速发展（图4）。固相迭代合成是最经典的手段，借鉴多肽合成的经验，可在不溶性载体上逐步添加单体（图4a）。近年来，基于硫代内酯的无保护基固相合成已可制备类肽结构的序列定义寡聚物，而亚单体合成法也便于在精确位置引入氨基乙基、胍基乙基和季铵基团等阳离子侧链。固相法极其适合自动化，可快速生成用于筛选的组合库，但其规模化能力和高昂成本仍是瓶颈。溶液相迭代指数增长法通过单体偶联形成寡聚物，再将寡聚物相互偶联实现链长的指数级扩展，能够制备固相载体难以达到的高分子量序列定义聚合物（图4b）。正交化学（如Passerini三组分反应、硫醇-马来酰亚胺迈克尔加成、无保护基点击化学）为这一策略提供了灵活的工具。不同于固相法受限于树脂载量，溶液法可通过反应工程放大生产，对临床转化所需的克级至公斤级制备尤为关键。连续流化学则将迭代的精确性与连续处理的高效性结合起来，在线NMR或色谱分析可提供实时监控与自适应控制，反应参数自动调整以优化产物（图4c）。流式条件下已可制备具有精确共聚单体排列的64单元PLGA链，结合迭代指数增长法甚至可在10分钟内完成带在线纯化的半自动序列定义聚合物合成。流动化学有潜力将序列定义聚合物从“定制合成”转变为稳健的“制造平台”。后聚合修饰则为合成策略提供了另一维度的灵活性（图4d）。首先生成带有正交官能团的前体聚合物，再通过巯基-烯修饰、叠氮-炔点击化学或活化酯反应进行“装饰”，可在保持序列定义的同时引入光开关偶氮苯、温敏聚异丙基丙烯酰胺等功能基团。而将后修饰与迭代指数增长结合，更可制备高度可定制、立体化学受控的序列定义高分子。超分子模板法则是思路最为独特的合成路径——它模拟生物体系中的碱基互补配对，利用DNA样模板的氢键作用控制单体排列（图4e），甚至可将非天然氨基酸通过质粒DNA模板在工程化大肠杆菌中合成序列定义聚合物（据原文报道，工程化大肠杆菌已可利用多达7种非天然氨基酸作为单体）。动态共价化学结合模板还具备“校对”和“纠错”的潜力，可显著提高合成保真度。DNA纳米技术进一步将氢键和超分子模板的概念扩展到二维和三维，为序列定义聚合物开辟了更广阔的设计空间。

图4 | 序列定义聚合物的合成方法。在这些示意图中，非反应性官能团（通常被保护）用大写字母表示，而用于偶联的反应性官能团用小写字母表示。化学性质不同的单体用不同颜色表示。a，在固相载体上的迭代生长通过逐步脱保护-添加单体或寡聚物实现单体的精确排序。b，迭代指数增长法提供了一条制备更长聚合物同时保持序列定义的途径。在迭代指数增长法中，寡聚单元先在发散反应步骤中构建，然后在收敛步骤中组合。所得序列定义的寡聚单元被反馈以替代单体，进入下一轮发散和收敛合成循环，每次迭代循环产生一条指数增长的序列定义聚合物链。c，流动化学可集成在线监测和反馈以进行连续反应。也可增加复杂性并包含收敛合成步骤，但这种方法的实用性目前仍有限。d，在迭代指数增长法背景下结合后聚合修饰（又称IEG+），为制备高度可定制的高分子量序列定义聚合物提供了一条途径。e，模板策略利用分子模板（例如DNA）将单体聚集在一起并促进其按预定排列进行偶联。在该示例中，蓝色和橙色单体通过互补DNA序列结合在一起并发生反应。更多单体可添加到生长链上，产生序列定义聚合物。（1）单体在DNA模板上的可逆结合；（2）单体偶联；（3）沿DNA模板释放并进一步偶联单体；（4）从模板上释放已完成的聚合物。

理解这些精密设计的聚合物在细胞内的行为，离不开先进成像技术的支撑（图5）。传统终点分析法（如报告基因表达检测）只能提供有限信息，而超分辨光学显微镜已可将单个复合物在细胞内的定位精确到20-50纳米，并揭示多聚复合物的化学计量比、内体逃逸细节和货物释放动力学（图5A）。膨胀显微镜通过物理放大样品获得纳米级分辨率，也已成功应用于多聚复合物的观察。电子显微镜和冷冻电镜虽在脂质纳米颗粒研究中应用广泛，但对于聚合物-核酸复合物来说，载体与货物往往难以区分。关联光学与电子显微镜则结合了荧光的分子特异性和电镜的超微结构信息，在冷冻条件下实现的3D关联显微镜有望在不引入制样假象的前提下，精确揭示多聚复合物与细胞的相互作用。纳米级二次离子质谱与电镜联用可提供约40纳米空间分辨率下的亚细胞定位信息，已成功追踪核酸药物和聚合物在培养细胞及小鼠组织中的分布，揭示了肽段缀合对亚细胞运输的影响（图5B）。单粒子追踪技术则从静态测量迈向动态过程捕获（图5C）。通过追踪单个纳米结构在活细胞内的运动轨迹（随机扩散、瞬态受限或定向运动），研究者可区分多聚复合物的解离、微管运输或特定亚细胞器内的定位。此类技术能捕捉群体平均所掩盖的异质性——这对传统聚合物尤其重要，因其分散性、序列差异和多种内吞途径并行，导致内体逃逸的不完全和不同步。DNA-PAINT结合高速相机可在亚毫秒时间尺度上实现纳米级精度的轨迹重建。而机器学习框架的引入，更使自动粒子追踪和复杂轨迹的概率建模成为可能。高通量高内涵成像则提供了统计力量（图5D），通过自动显微镜与图像分析管道，可在大型聚合物库和大量细胞群体中同时评估细胞摄取、内体逃逸、细胞毒性和转染效率。“细胞绘画”等成熟方法可在单个细胞尺度上生成涵盖数百种形态特征的高维数据集，无偏倚地评估亚细胞特征的变化。遗憾的是，目前大规模筛选仍受限于序列定义聚合物的合成通量，整合高内涵成像与高通量组合/序列定义合成将是未来的关键方向。动物体内成像方面，活体显微镜和全动物成像可观察多聚复合物在血管内的分布、组织穿透和药代动力学（图5E）。与空间转录组学和蛋白质组学的整合代表了新兴的前沿——通过关联多聚复合物分布与局部表达变化，可能揭示影响递送效率的宿主因素，为系统级理解奠定基础。

图5 | 多模态成像技术揭示多聚复合物行为。A，超分辨光学显微镜揭示了纳米级分辨率下的多聚复合物结构和化学计量，以及内体逃逸和货物释放的动力学。B，关联电子显微镜/纳米级二次离子质谱区分多聚复合物保留与货物释放，揭示亚细胞定位。C，单粒子追踪揭示活细胞内多聚复合物的迁移率和运输模式，区分扩散、受限和定向运动，并将动态行为与递送效率相关联。D，高内涵成像与机器学习相结合，可大规模测试聚合物库的转染效率。E，全动物成像显示多聚复合物在组织水平和器官水平的生物分布、清除途径和脱靶累积。

计算方法的介入则为序列空间过于庞大而难以穷举实验的难题提供了出路（图6）。分子动力学模拟涵盖了从全原子到粗粒化的多尺度方法（图6A）。全原子模拟可预测特定单体序列如何影响核酸结合取向、复合物稳定性和构象柔性——早期研究已揭示DNA与线性聚赖氨酸、聚乙烯亚胺等结合时在结合动力学、结合模式（静电结合骨架还是嵌入双螺旋沟槽）以及结合强度/解装配上的差异。粗粒化模拟则通过简化表示克服计算复杂度的限制，已用于树状大分子家族研究拓扑结构和溶剂化如何影响分子对接、膜相互作用和自组装。随着百亿亿次计算资源的涌现，全细胞建模正在成为可能，其与实验数据的整合可建立反馈回路用于聚合物序列优化。与物理模拟平行的另一条路径是统计与机器学习方法（图6B-C）。数据稀缺是目前最直接的瓶颈——聚合物递送研究的数据集规模小、异质性强、实验条件各异。贝叶斯层次建模和荟萃分析可帮助跨小数据集汇集信息并量化不确定性。与此同时，开发适合序列定义聚合物的分子描述符也是一项核心挑战——与现有大量小分子和蛋白质描述符不同，序列信息在大型拓扑复杂聚合物系统中的表征需要能够同时捕获局部和整体结构特征的专业方法。随机森林、梯度提升机和神经网络等监督学习方法已在特定场景中展现潜力，而贝叶斯优化则可智能地基于先前结果选择性设计后续实验，理论上可大幅加速序列发现。最引人注目的是，将计算模型与自动合成和高内涵表征整合为闭环优化平台——实验数据不断精炼预测模型，模型反过来指导下一代聚合物设计——这一愿景有望将聚合物开发从经验性探索转变为系统性的工程实践。

图6 | 计算方法实现对序列定义聚合物载体的多尺度理解和理性设计。该图说明计算方法如何跨越分子水平相互作用、数据抽象和概率建模，将聚合物序列与递送功能联系起来并指导迭代设计。A，分子动力学模拟揭示聚合物如何与核酸相互作用，捕获构象集合、结合模式和协同效应，这些在分子尺度上决定了凝聚、稳定性和释放。示例包括阳离子聚合物（黄色）与DNA结合的全原子模拟（Aa部分），以及不同分子量支化聚乙烯亚胺与siRNA结合的粗粒化模拟（Ab部分）。粗粒化模拟还可模拟更大尺度体系之间的相互作用，如树状大分子与膜脂质之间的相互作用（Ac部分）。B，特征抽象将化学结构转化为定量设计描述符，通过可解释的变量（如电荷间距、图案化和架构）实现对序列定义聚合物的系统表征。C，数据驱动模型在不确定性下推断结构-功能关系，整合异质性实验数据集以识别稳健趋势，同时明确考虑生物变异性和实验噪声。

综述最后指出（图7），面向未来，有三个优先方向必须推进：其一，发展既能保持序列精度又能实现规模化生产的高效合成方法，架起概念验证与应用之间的桥梁（图7a）；其二，建立标准化的表征与筛选平台和共享数据库，使不同实验室生成的数据可比较、可汇集，为计算分析提供具有统计效力的数据集（图7b）；其三，利用先进成像开展机制研究，为理性设计奠定基础（图7c）。将这三者整合至统一的发现平台——闭环连接合成、自动成像与分析，并实现在线反馈——将有望变革聚合物基因递送的研发模式（图7d-e）。同时，综述也冷静指出，尽管脂质纳米颗粒在临床和临床前阶段取得显著成功，聚合物载体尚未在转化性能上超越脂质体系。但在肝外递送、大蛋白货物（如Cas9核糖核蛋白）包封、重复给药（抗PEG抗体应答可削弱脂质纳米颗粒效果）以及室温稳定性需求等应用场景中，聚合物仍具有独特优势。从基础研究角度看，探索序列定义聚合物的构效关系本身具有不可替代的科学价值，但严谨的头对头比较验证将是提升这一新兴材料类别转化影响力的关键。最终，在序列定义合成、先进成像和计算建模的交汇点上，聚合物介导的基因递送有望从经验探索走向预测科学，为基因治疗开辟更广泛的临床应用前景。

图7 | 将序列定义聚合物转化为可靠的基因治疗非病毒载体的框架。我们提出一份路线图，引导该领域从随机的、分散的聚合物（其中少数“幸运”序列主导递送）转向理性的分子——完全从第一性原理设计，实现可预测的基因递送。a，首要步骤必须是将小规模台式合成方法放大为能够大规模生产序列特异性聚合物库并批量鉴定最优候选物的体系。b，这些大规模库必须伴随聚合物计算表征和高通量筛选方法的进步，使数据集易于被机器学习、统计分析和其他计算方法所解读。c，此外，先进成像技术将为科学家提供急需的序列定义聚合物机制分析。这些数据也可整合到计算数据集中，用于理性的、机器辅助的载体设计。d，在以上三部分建立后，它们可开始整合到一个单一的半自动化工作流中，为定制聚合物提供闭环反馈。e，该工作流的发展将带来对特定序列效应的实证验证，识别更简单、更具成本效益的仿效物，并推动聚合物基因递送载体向临床应用的转化。