神经元核内包涵体病（NIID）是一种成人起病的神经退行性疾病，由 NOTCH2NLC 基因 5'UTR 区 GGC 重复序列异常扩张导致，临床表现为痴呆、肢体无力、震颤等，严重者可致瘫痪甚至早亡。目前尚无有效治疗手段，仅能对症缓解，且NOTCH2NLC 与同源基因序列相似度极高（<2% 差异），给精准基因编辑带来巨大挑战。

近日，中南大学湘雅医院、暨南大学等联合团队在《Nature Communications》（IF=15.7，神经领域顶刊，开源获取，0 版面费）发表重磅研究：开发出靶向 NOTCH2NLC 基因的特异性 CRISPR/Cas9 编辑策略，通过双 sgRNA 精准切除异常扩张的 GGC 重复序列，在细胞、患者 iPSC 及转基因小鼠模型中均证实其安全性与有效性，显著逆转疾病相关病理和行为异常。

文章信息速览

原标题：Precise excision of expanded GGC repeats in NOTCH2NLC via CRISPR/Cas9 for treating neuronal intranuclear inclusion disease

期刊：Nature Communications（IF=15.7，神经领域顶刊，开源获取，0 版面费）

关键词：神经元核内包涵体病（NIID）、CRISPR/Cas9、基因编辑、GGC 重复序列扩张、NOTCH2NLC、多模型验证、脱靶效应、神经退行性疾病

研究背景与临床痛点

治疗困境：NIID 无有效治疗手段，传统药物仅能缓解症状，无法阻断疾病进展，患者预后极差；

技术瓶颈：NOTCH2NLC 与 NOTCH2/NOTCH2NL 家族基因序列相似度极高（<2% 差异），常规基因编辑易产生脱靶效应，破坏正常基因功能；

机制明确但无靶向方案：异常扩张的 GGC 重复序列可翻译为毒性多聚甘氨酸（polyG），形成核内包涵体驱动病理，但缺乏精准靶向重复序列的治疗技术；

重复扩张疾病共性难题：GGC/CCG 重复序列扩张相关疾病达数十种，均面临靶向治疗匮乏的问题，亟需可推广的技术范式。

研究核心亮点

这篇 IF=15.7 顶刊的成功，核心在于 “精准靶向设计 + 多维度验证 + 临床转化导向” 的研究框架，5 大关键步骤完美契合神经领域顶刊发表逻辑，关键结果均有图表强力支撑：

1. 第一步：破解同源基因干扰，设计特异性 CRISPR 编辑策略（图 1）

核心挑战：NOTCH2NLC 与同源基因 NOTCH2/NOTCH2NL 家族序列高度同源，仅 GGC 重复序列两侧存在 2 个 mismatch 区域；

设计方案：针对这两个特异性区域设计双 sgRNA（sgRNA1+sgRNA6 等组合），避开同源序列，确保编辑特异性；

体外验证：在 HEK293 细胞中，sgRNA1+5、sgRNA1+6 组合编辑效率达 33%~40%，TA 克隆 + Sanger 测序证实仅靶向 NOTCH2NLC，同源基因无脱靶（图 1H-J）；

图1

关键价值：解决了高同源基因编辑的特异性难题，为同类疾病提供技术参考。

2. 第二步：细胞模型验证，高效降低毒性 polyG 水平（图 2）

模型构建：建立稳定表达 NOTCH2NLC-98GGC-GFP 的 HEK293 细胞系（98polyG 细胞），模拟 NIID 的 polyG 毒性表型；

核心结果：CRISPR 编辑后，细胞内聚集型和可溶性 polyG 蛋白水平分别降低 49.0%~51.7% 和 67.6%~78.4%，polyG 聚集数量减少 63.1%~69.7%（图 2D-G）；

机制确认：PCR 和测序证实 GGC 重复序列成功切除，验证编辑策略对毒性源的直接靶向作用。

图2

3. 第三步：患者 iPSC 模型验证，逆转转录组异常且无脱靶（图 3）

模型构建：从 NIID 患者 PBMC 诱导 iPSC，其 NOTCH2NLC 基因 GGC 重复序列为 113/17 次（正常对照 19/18 次），分化为神经前体细胞（NPCs）；

编辑效果：通过 CRISPR 编辑获得 GGC 重复序列删除或修复的 iPSC 克隆，NPCs 转录组图谱更接近正常对照，74.74% 的上调基因和 50.88% 的下调基因恢复正常，富集于神经功能相关通路（图 3C-J）；

安全性验证：深度测序（deep-seq）检测 20 个潜在脱靶位点，全基因组测序（WGS）分析 SNP、InDel 等，均未发现显著脱靶，编辑后 iPSC 保持正常核型和多能性（图 3A-B）。

图3

4. 第四步：小鼠局部治疗，改善脑内神经病理（图 4）

模型选择：采用自主构建的 NIID 转基因小鼠（全身表达 NOTCH2NLC-98GGC），该模型可再现核内包涵体、神经退行等病理特征；

治疗方式：向小鼠纹状体立体定向注射 AAV-PHP.eB 包装的 CRISPR/Cas9 系统（治疗侧）和对照 sgRNA（对照侧）；

核心结果：治疗侧 polyG 聚集显著减少，星形胶质细胞激活标志物 GFAP、小胶质细胞标志物 IBA1 表达降低，神经元标志物 NeuN 表达升高，神经炎症和退行表型明显改善（图 4A-D）。

图4

5. 第五步：小鼠全身治疗，逆转行为异常并延长生存期（图 5、6）

治疗方式：新生 NIID 小鼠经眼后静脉注射 AAV 载体，实现全身递送 CRISPR 系统；

行为学改善：治疗后小鼠在旷场试验中移动距离和时长显著增加，悬丝试验、转棒试验中运动协调能力接近正常对照（图 5B-H）；

生存期延长：Kaplan-Meier 分析显示，治疗组小鼠生存期较未治疗组显著延长（图 5I）；

分子与病理逆转：大脑皮层 polyG 和 GFAP 水平降低，NeuN 水平升高；转录组分析显示，未治疗组 1789 个上调基因和 334 个下调基因中，58.69% 和 52.10% 恢复正常，富集于神经功能和炎症反应通路（图 6A-I）；外周心脏组织的 polyG 水平也降低 79%，转录组异常同步改善。

图5

图6

总结：多模型验证 + 精准靶向，顶刊论文的核心逻辑

中南大学湘雅医院、暨南大学联合团队的这项研究，完美诠释了“临床痛点切入→技术瓶颈突破→多模型层层验证→临床转化落地” 的顶刊研究闭环，其成功关键在于：

靶向精准：聚焦疾病核心致病因子（GGC 重复序列），针对同源基因干扰设计特异性策略，解决领域关键技术难题；

验证全面：从体外细胞→患者 iPSC→小鼠局部治疗→小鼠全身治疗，覆盖从基础到体内的完整验证体系，结果可信度高；

安全性优先：通过 deep-seq、WGS 等多维度验证无脱靶效应，为临床转化奠定基础；

价值延伸：不仅为 NIID 提供潜在治愈方案，还为 FMR1、C9ORF72 等重复扩张疾病提供可借鉴的基因编辑范式。

对于医生而言，这类顶刊论文的发文逻辑可直接复用：先明确临床未满足需求，再针对性开发或优化技术，通过“体外→细胞→动物” 的多模型验证体系夯实结论，最后突出临床转化价值。

原文DOI：10.1038/s41467-026-68385-5